Hiếu Định hoàng thái hậu mang họ Lý (李氏), sinh ngày 19 tháng 11 (âm lịch) năm Gia Tĩnh thứ 19 (1540), nguyên quán Thông Châu, cha bà là Tặng Vũ Thanh bá Lý Vĩ (李伟). Bà xuất thân con nhà tiểu thương họ Lý ở Thông Châu, khi 15 tuổi đi theo hầu hạ Dụ vương Kế phi Trần thị khi ấy nhập vào vương phủ làm Kế thất của Dụ vương Chu Tái Hậu (Minh Mục Tông). Vì Lý thị có dung mạo xinh đẹp nên được Dụ vương yêu mến, nạp làm thiếp.

Năm Gia Tĩnh thứ 36 (1557), Lý thị sinh Thái Hòa công chúa (太和公主), đến năm 3 tuổi thì công chúa chết yểu. Năm thứ 42 (1563), Lý thị sinh hạ vương tôn Chu Dực Quân, là con trai thứ ba của Dụ vương.

Năm 1566, Minh Mục Tông kế vị, phong Trần Vương phi làm Hoàng hậu, phong cho Lý thị làm Quý phi. Năm Long Khánh thứ 2 (1568), con trai bà là Chu Dực Quân được phong làm Hoàng thái tử.

Bấy giờ, Hiếu An hoàng hậu Trần thị nhiều bệnh mà không con, trong khi đó Lý Quý phi có con trai là Thái tử, cho nên có lời dị nghị Lý Quý phi sẽ ỷ sủng sinh kiêu, khinh thường Hoàng hậu. Trái lại, Lý Quý phi đối với Trần Hoàng hậu muôn phần kính trọng, Thái tử cũng rất kính trọng Hoàng hậu.